关于龙舌兰酒的发酵简介：接下来，工人会在称为Tepache的龙舌兰草汁上洒下酵母，虽然根据传统做法，制造龙舌兰酒使用的酵母采集自龙舌兰叶上，但今日大部分的酒厂都是使用以野生菌株培育的人工酵母，或甚至商业上使用的啤酒酵母。有些传统的Mezcal或是Pulque酒，是利用空气中飘散的野生酵母造成自然发酵，但在Tequila之中只有老牌的马蹄铁龙舌兰（TequilaHerradura）一家酒厂是强调使用这样的发酵方式。不过，某些人认为依赖天然飘落的酵母，风险太大，为了抑制不想要的微生物滋生，往往还得额外使用来控制产品稳定度，利与弊颇值得争议。
用来发酵龙舌兰汁的容器可能是木造或现代的不锈钢酒槽，如果保持天然的发酵过程，其耗时往往需要7到12天之久，为了加速发酵过程，许多现代化的酒厂透过添加特定化学物质的方式加速酵母的增产，把时间缩短到两三日内。较长的发酵时间可以换得较厚实的酒体，酒厂通常会保留一些发酵完成后的初级酒汁，用来当作下一次发酵的引子。